Биохимические маркеры окислительного стресса

Избыточное поступление в организм кобальта индуцирует перекисное окисление липидов и способствует формированию окислительного стресса, сопровождающегося дисфункцией эндотелия, повреждением биологических макромолекул, мембранных структур клеток и ферментов [8]. Принимая на себя влияние солей тяжелых цветных металлов, эндотелий становится прямой мишенью для повреждения, и эндотелиальная дисфункция играет патогенетическую роль в повреждении мембран клеток внутренних органов в условиях окислительного стресса.

Цель исследования – изучение биохимических и функциональных показателей гемодинамических нарушений и повреждений внутренних органов при кобальтовой интоксикации.

Материал и методы исследования

Для реализации данной цели исследования проведены на крысах-самцах линии «Wistar» одной возрастной группы (10–14 мес.), массой 220–250 г. У экспериментальных крыс моделировали кобальтовые ангиопатии парентеральным введением хлорида кобальта в дозе 6 мг/кг веса животного в течение месяца.Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977 г.), а также принципам Хельсинкской декларации (2000 г.). В эксперименте мы исследовали следующие показатели: интенсивность ПОЛ в эритроцитах, гомогенатах почечной, печеночной и миокардиальной тканей по данным изменения концентрации МДА, определяемого колориметрическим методом с тиобарбитуровой кислотой [9]; состояние антиокислительной системы (АОС) оценивали по активности каталазы [6] и СОД по методу аутоокисления адреналина, концентрацию церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови – метод Равина [5]. Изучали активность Na+, K+-АТФ-азы в корковом и мозговом слоях почечной, а также в печеночной и миокардиальной тканях по приросту неорганического фосфора в среде инкубации по методу Scou ТС (1957). Содержание в плазме крови стабильных суммарных конечных метаболитов оксида азота (NO2– и NO3– или NOx) исследовали с помощью реактива Грисса в реакции деазотирования, согласно модифицированному экспресс-методу [7]. Для оценки активности органоспецифических ферментов определяли в крови активность трансаминаз (AлАT, AсАT), ГГТП и щелочной фосфатазы наборами фирмы «Витал».

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики, принимая во внимание вариации динамических рядов, и оценивали корреляцию, учитывая ее достоверность по стандартным таблицам (Л.С. Каминский) с использованием программы статанализа «Statistika 6.0 for Windows» фирмы «Stat Soft, Juc» и «Microsoft Office Excel 2003».

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных результатов по определению содержания кобальта в плазме крови и моче выявил прямые корреляционные связи между дозой вводимого хлорида кобальта и содержанием в плазме крови (r = +0,66) при подкожном введении хлорида кобальта в течение месяца (r = +0,61) и в моче в течение 1 месяца после введения соли (r = +0,72). На фоне хронической интоксикации хлоридом кобальта в дозе 6 мг/кг развивается окислительный стресс, который приобретает системный характер, повышается концентрация МДА в эритроцитах, гомогенатах почечной, печеночной и миокардиальной тканей сравнительно с контрольной группой (рис. 1).

Рис. 1. Изменение биохимических показателей крови и внутренних органов на фоне интоксикации хлоридом кобальта

Анализ данных активности ферментов АОС организма показал, что в условиях оксидативного стресса у крыс с интоксикацией хлоридом кобальта в течение 1 месяца выявляется снижение активности СОД в крови (p + , K + -АТФ-азы в корковом и мозговом слоях почечной ткани, а также в гомогенатах печени и миокарда (рис. 3).

Рис. 2. Активность ферментов АОС в условиях кобальтовой интоксикации у крыс

Рис. 3. Активность Na+, K+-АТФ-азы внутренних органов у крыс с экспозицией хлоридом кобальта

Рис. 4. Активность ферментов сыворотки крови в условиях экспериментальной кобальтовой интоксикации

Биохимическими маркерами повышения проницаемости клеточных мембран являются изменения активности ферментов сыворотки крови. В результате активации ПОЛ происходит нарушение проницаемости клеточных мембран кардиомиоцитов и гепатоцитов, повышение в крови активности трансаминаз: АлАТ, АсАТ, мембранного фермента – ГГТП и экскреторного щелочной фосфатазы (рис. 4).

Заключение

При хронической кобальтовой интоксикации в течение 1 месяца отмечается развитие системного окислительного стресса, который сопровождается снижением содержания суммарных метаболитов NO и повреждением клеточных мембран внутренних органов – почек, печени и миокарда по данным угнетения активности Na + , K + -АТФ-азы. Другим показателем нарушения проницаемости цитоплазматических мембран внутренних органов является повышение в сыворотке крови следующих ферментов: АлАТ, АсАТ, ГГТП и щелочной фосфатазы. Участие дисфункции эндотелия в нарушении функциональной способности внутренних органов установлено в нашей лаборатории в других исследованиях [3].

Рецензенты:

Брин В.Б., д.м.н., профессор, зав. отделом физиологии и патологии висцеральных систем, ФГБУН «Институт биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства РСО‒Алания», г. Владикавказ;

Джиоев И.Г., д.м.н., профессор, зав. центральной научно-исследовательской лабораторией, ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владикавказ.

Источник

Биохимические маркеры окислительного стресса

Формирование многих патологий, таких как сахарный диабет, интоксикационный синдром, сопряжено с развитием окислительного стресса. Неблагоприятная экологическая обстановка вообще, и в нашем регионе в частности, представляет серьезную опасность для здоровья населения [1; 2]. Ионы цветных металлов поступают перорально через органы дыхания и наружные покровы. Повышенные концентрации никеля обладают мутагенными, аллергическими свойствами, вызывают образование АФК (активных форм кислорода) и онкопатологию. Чрезмерное поступление в организм никеля, кадмия, кобальта индуцирует свободнорадикальное окисление липидов, что способствует развитию дисфункции эндотелия в результате повреждения мембранных структур клеток сосудистой стенки [3]. На фоне влияния солей тяжелых металлов повреждается нитрооксидпродуцирующая функция эндотелия сосудов. Особое внимание в этом плане привлекает оксид азота (NO), как молекула — посредник реагирования клеток органов. Продуцируется оксид азота клетками эндотелия сосудов из L-аргинина с участием фермента NO-синтазы [4]. Различают 2 изоформы NOS — конститутивные: эндотелиальная — eNOS (NOS-3) и нейрональная nNOS (NOS-1), активность которых является Са-зависимой. Помимо этих двух видов, существует индуцибельная — iNOS (NOS-2), активируемая эндотоксинами и провоспалительными цитокинами [5; 6]. Поскольку основным субстратом синтеза NO является L-аргинин, то представляется интересным вопрос о биодоступности субстрата к eNOS, факторы, влияющие на этот процесс, а также влияние L-аргинина и его модифицированного производного L-NAME (NG-нитро-Lаргинин метиловый эфир) на продукцию оксида азота. Выяснение маркеров эндотелиальной дисфункции, которая сопровождается нарушением баланса между вазоконстрикцией и вазодилатацией, представляет научный интерес. В связи с изложенным не менее важной является разработка способов коррекции.

Цель исследования: выявление биохимических маркеров, свидетельствующих о механизмах нарушения окислительно-восстановительных процессов в условиях действия экопатогенных факторов и разработка способа их коррекции.

Материал и методы исследования. Подопытные биологические объекты (крыс подбирали по массе и возрасту) состояли из 5 групп: 1-я — контрольная, 2-я — с моделью никелевых ангиопатий в дозе 0,5 мг/кг веса животного, 30 дней парентерально, 3-я и 4-я группы — введение L-NAME (25 мг/кг) интактным и интоксифицированным крысам, 5-я группа — введение коэнзима композитума (10 мг/кг, 30 дней) на фоне интоксикации хлоридом никеля. Экспериментальные исследования соответствовали требованиям проведения работ с использованием экспериментальных животных и условиям Хельсинкской декларации. В работе определяли: интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах, гомогенатах ренальной ткани по концентрации диальдегида малоновой кислоты (МДА) на фотоэлектроколориметре (ФЭК) по методу Asacawa; состояние антиокислительной защиты клеток (АОЗ) — по активности каталазы (метод Королюка М.И) и супероксиддисмутазы (СОД) по аутоокислению адреналина, концентрацию церулоплазмина (ЦП) в сыворотке по методу Равина. Активность натриевого насоса в ткани почек — методом Scou ТС (1957). Содержание в плазме крови суммарных конечных метаболитов оксида азота (NO_x) определяли с реактивом Грисса. С целью выявления предатерогенных изменений в сосудистой системе изучали метаболизм холестерина: общий холестерин (ХС), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП), холестерин липопротеинов низкой плотности ХС ЛПНП, триацилглицериды (ТАГ).

Для выявления достоверности показателей использовали программы статанализа Statistika 6.0 и Microsoft Office Excel.

Результаты исследования и их обсуждение. Избыточные концентрации ионов никеля в плазме крови и выделение почками при регулярном введении регенерируют активные радикалы, стимулирующие ПОЛ в красных кровяных клетках, а также во внутренних органах. Маркером этих изменений является повышение содержания альдегида малоновой кислоты в клетках крови, коркового и мозгового вещества ренальной ткани.

Свое участие в развитие окислительного стресса вносит нарушение ферментативной составляющей антиокислительной системы (АОС) организма. Она обеспечивается СОД, глютатионредуктазой и пероксидазой. Второй линией антиоксидантной защиты является каталаза, оксидоредуктаза, расщепляющая пероксид на молекулу кислорода и воды. Церулоплазмин в плазме крови выполняет антиоксидантную функцию. Наши данные показали снижение активности СОД в эритроцитах на 65% и повышение активности каталазы и ЦП на 39% и 16,7% соответственно, как проявление компенсаторной реакции организма. Эти данные идут в унисон со сведениями литературы, свидетельствующими об индуцировании ионами тяжелых металлов процесса ПОЛ [3].

Образующийся супероксид-анион радикал взаимодействует с оксидом азота, что способствует снижению концентрации в сыворотке крови суммарных метаболитов NO. При этом образуется сильный окислитель — пероксинитрит. Важную роль играет путь передачи сигнала от L-aргинина к NO, т.е. механизм транспорта L-аргинина к эндотелиальной NO-синтазе и нарушение экспрессии eNOS [7]. В этом плане одной из возможных причин препятствия транспорту L-аргинина к эндотелиальной NO-синтазе могут быть метаболические изменения, в частности обмена холестерина. Повышенное содержание холестерина в сыворотке крови является фактором риска развития атеросклероза в эндотелии сосудов. Более того, следует заметить, что в этом процессе важную роль играют ЛПНП. В наших исследованиях при систематической интоксикации хлоридом никеля отмечается гиперхолестеринемия и гипер-β-липопротеинемия при снижении ХС ЛПВП. Принимая во внимание условия окислительного стресса, предатеросклеротическое поражение (липоидоз) в интиме развивается при неконтролируемом захвате циркулирующих в кровяном русле холестеринсодержащих ЛПНП клетками стенки сосудов, в результате чего образуются богатые липидами «пенистые клетки». Окислительной модификации подвергаются фосфолипиды наружного слоя ЛПНП, так как в крови имеется большое количество индукторов окисления: кислород, ионы железа, гемопротеиды. В процессе окисления ЛПНП первичные продукты — липопероксиды в результате окислительной деструкции продуцируют α-оксоальдегиды, подобные МДА. Альдегидные группы МДА способны легко реагировать с Σ-аминогруппами аргинина в апопротеине В100 частиц ЛПНП. Происходит окислительная модификация белковой молекулы, она реагирует со «скэвинджер» рецепторами фагоцитов, обеспечивая более эффективный захват липопротеиновых частиц с образованием «пенистых клеток». Одновременно с этим происходит угнетение аффинности ЛПНП к собственным рецепторам, что поддерживает повышенное содержание холестерина в крови. Следует подчеркнуть, что эти изменения в метаболизме холестерина препятствуют транспортному механизму. Помимо этого фактора, на содержание оксида азота может оказывать влияние сам субстрат L-аргинин и его модифицированное производное L-NAME. Возможность использования L-аргинина NO-синтазой определяли в другом варианте исследований на фоне экспозиции хлоридом никеля в течение 30 дней. Результаты показали антиоксидантные свойства аминокислоты по данным снижения содержания МДА в крови. Адаптивная система в условиях снижения интенсивности ПОЛ показала повышение активности СОД и снижение уровня каталазы и ЦП (рис.). Эти изменения способствовали повышению концентрации NO на фоне L-аргинина в токсических условиях. Модифицированный L-аргинин — L-NAME показал противоположные результаты: повышение интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) при ингибировании АОС, что сопровождалось более выраженным снижением концентрации NO сравнительно с уровнем при интоксикации. Наряду с этим L-аргинин оказал позитивное влияние на липопротеиновые фракции, способствуя нормализации в обмене холестерина, одновременно улучшал биодоступность аминокислоты к eNOS. При введении L-NAME животным в токсических условиях отмечались противоположные аргинину результаты, сопровождающиеся более значительным снижением уровня оксида азота.

У экспериментальных животных в хронической стадии интоксикационного синдрома гемодинамические изменения в сосудах почек приводили к повышенному выделению с мочой калия и натрия. Причиной этих изменений было нарушение фильтрационно-реабсорбционных процессов, для выяснения которых определяли функцию фермента АТФ-азы, активируемой Na и K в гомогенатах почечной ткани. У подопытных животных с интоксикационным синдромом выявлено достоверное понижение активности функционального состояния Na + /K + -АТФ-азы в корковом и мозговом веществе ренальной ткани относительно контроля (р + /K + -АТФ-азы. Действительно, в эксперименте нами было установлено угнетение функциональной способности энзима и показано наличие обратной взаимосвязи между содержанием МДА и активностью Na + /K + -АТФ-азы в корке (r= -0.8) и медулле ренальной ткани (r= -0.75).

С целью коррекции негативного влияния интоксикационного синдрома на метаболические нарушения подавали коэнзим композитум длительностью один месяц. В состав этого препарата входит витамин Е и коэнзим Q. Применяя его, мы исходили из следующих представлений: витамин Е обладает способностью предотвращать окислительный стресс и нарушение липидной фазы цитоплазматических мембран. Восстановленная форма α-токоферола образуется с участием гидрофобного начала -убихинола. Сам по себе убихинол (QH₂) является восстановленной формой убихинона (UQ), т.е. коэнзима Q₁₀. Это активный антиоксидант, предотвращающий ПОЛ липидов мембран. Будучи в составе Q-цикла, происходят окислительно-восстановительные реакции в цепи переноса электронов, что и обеспечивает его регенерацию. Он же поддерживает и α-токоферол в восстановленной форме. Синтез коэнзима Q₁₀ осуществляется из аминокислоты тирозина при участии кофакторов из витаминов группы В и микроэлементов, а боковая углеводородная цепь образуется из мевалоната — промежуточного предшественника синтеза холестерина. С другой стороны, убихинон индуцирует энергообразование и угнетение супероксид-анион радикала (O₂ — ) в реакции сукцинатдегидрогеназы. Все эти метаболические изменения позитивного характера являются показателем его эффективности в ингибировании липопероксидации. Полученные результаты демонстрируют снижение интенсивности ПОЛ по данным содержания МДА в красных кровяных клетках крови, корковом и мозговом веществе ренальной ткани под влиянием коэнзима композитума.

Влияние коэнзима композитума на систему ПОЛ — АОС и содержание оксида азота при интоксикации хлоридом никеля

С целью изучения вопроса, насколько эффективно влияние препарата на ферментативную составляющую АОЗ, изучали взаимосвязь между активностью ПОЛ и дисмутазной реакцией (СОД), что показало обратную связь (r=-0.46; р + /K + -АТФ-азы как в корковом, так в мозговом слоях почек соответственно на 27,3% и 30,13% вследствие адекватности окисления в цепи переноса электронов.

Следовательно, используемый в эксперименте препарат коэнзим композитум оказал положительное влияние на функцию сосудистого эпителия, что подтверждается повышением содержания оксида азота — как вазодилататора в крови у животных с интоксикационным синдромом, получавших этот препарат в течение месяца. На фоне лечения коэнзимом композитумом коррекция дисфункции эндотелия сопровождалась достоверным улучшением микроциркуляции в сосудах почек вследствие повышения содержания вазодилататора в крови на фоне антиоксиданта.

Заключение. Окислительный стресс при систематической интоксикации хлоридом никеля приводит к недостатку основного вазодилататора – NO, вследствие дефицита и снижения биодоступности L-аргинина, необходимого для образования оксида азота. В механизмах нарушения транспорта субстрата синтеза NO играет роль гиперхолестеринемия и гипер-β-липопротеинемия. Активные формы кислорода вызывают окислительную модификацию фосфолипидов и апопротеина В100, что способствует большей их атерогенности. С другой стороны, образующийся оксид азота, реагируя с активными радикалами, играет роль антиоксиданта и препятствует негативным изменениям в артериолах и капиллярах. Показателем эффективности данного антиоксиданта является ингибирование липопероксидации, повышение NO-образующей функции и дилатация мелких сосудов органов, включая почки. Кроме этого, на фоне применения коэнзима композитума происходит нормализация молекулярной структуры фосфолипидов клеточных мембран канальцев почек, адекватное восстановление кислорода в цепи переноса электронов и энергообразования, как активирующий фактор для фермента Na + /K + -АТФ-азы. Следовательно, на фоне введения коэнзима композитума снижаются проявления микрососудистых осложнений интоксикационного синдрома, включая вазоренальную патологию.

Источник